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柑橘顽固病是柑橘生产上一种严重的病害。在炎热的气候条件下，病害能大大降低果实的产量和质量。由于病害能通过昆虫介体传播，因此顽固病的防治很困难。其病原体Spiroplasma citri通过苗木和接穗传播，田间由叶蝉传播。柠檬螺原体侵染寄主韧皮部的筛管组织。病原体持久侵染植株，直到植株衰退。实际上，它是一种专性寄生物，存活在柑橘及其他寄主的体内，而不腐生在植株表面。因此快速灵敏检测柑橘顽固病螺原体具有重要意义。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 引物经过优化，灵敏性高，分析灵敏度可以达到100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是根据柑橘顽固病高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
   
5. 本制品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。
   
6. 既可用于定性，也可用于定量。用于定量时线性范围至少5个数量级。
   
7. 本制品只能用于科研。

1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。
   
3. 在6号管中加入5μL10⁷拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL10⁵拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL第6步所得的第4号稀释液(10⁴拷贝/μL)再加上一定量的水使总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
   
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容，也可使用本公司的免提取核酸释放剂。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	PCR阴性 对照管	PCR阳性对照管 (1～6管)
    2×SYBR qPCR MasterMix	10μL	10μL	各10μL
    柑橘顽固病螺原体染料法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
    N+2待测样品DNA模板	8μL	不加	不加
    自备超纯水	不加	8μL	不加
    第6步所得PCR阳性对照稀释液(1～6号)	不加	不加	各8μL

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	3min
    PCR反应 (35个循环)	95℃	15sec
    	60℃	1min(采集SYBR通道的荧光信号)
    溶解曲线分析

    注：循环次数不要超过35个循环。

12. 通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品(包括对照和待测样品)，归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
    
13. 如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
    
14. 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和PCR阴性对照)是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
    
15. 对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再换算出待测样品的DNA浓度。
    
16. 对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。